DADA2 pipeline - EspaƱol
Alexis Carteron & Simon Morvan
2021-09-13 16:21:59
IntroducciĆ³n
DADA2 es un pipeline bioinformĆ”tico creado por Callahan et al., 2016. Consiste es una serie de pasos que filtran las secuencias crudas obtenidas con la secuenciaciĆ³n de Illumina. El Ćŗltimo paso es obtener la taxonomĆa de las secuencias que han sido filtradas para estudiar la comunidad microbiana.
DADA2 tiene dos caracterĆsticas principales que lo distinguen de otros pipelines comĆŗnmente utilizados. Por un lado, procede a la modelizaciĆ³n del error de secuenciaciĆ³n que se supone permite distinguir las secuencias mutantes de las errĆ³neas. Por otro lado, a diferencia de otros pipelines como QIIME o Mothur, DADA2 no agrupa el 97% de las secuencias similares en unidades taxonĆ³micas operativas (Operational Taxonomy Units, OTU). Sus variantes de secuencia de ampliaciĆ³n (Amplicon Sequence Variants, ASVs) no se agrupan si las secuencias no son 100% idĆ©nticas. VĆ©ase la figura anterior.
Construido originalmente para secuencias del gen marcador 16S (Bacterias), lo utilizaremos con secuencias del gen marcador ITS (Hongos) procedentes de la secuenciaciĆ³n Illumina MiSEQ 2x300 bp paired-end. Para acelerar la ejecuciĆ³n de cada paso, submuestreamos aleatoriamente un conjunto de datos para conservar sĆ³lo 1000 secuencias por muestra. Por Ćŗltimo, Redde Caesari quae sunt Caesaris : este tutorial se ha inspirado en gran medida en el original tutorial DADA2.
En general, antes de iniciar este pipeline, debemos tomar algunas precauciones:
- Las muestras deben ser demultiplexadas: divididas en archivos fastq individuales por muestra.
- Si las secuencias estƔn emparejadas, las secuencias directa e inversa deben estar en archivos fastq distintos pero deben contener lecturas en orden coincidente.
- Si las secuencias estƔn emparejadas, las secuencias directa e inversa deben estar en archivos fastq distintos pero deben contener lecturas en orden coincidente.
- Los nucleĆ³tidos que no forman parte del amplicĆ³n (cebadores y adaptadores) deben ser eliminados. TambiĆ©n se pueden eliminar en el paso de filtrado.
- La mayorĆa de las funciones tienen una opciĆ³n de multihilo que permite un tiempo de cĆ”lculo mĆ”s rĆ”pido al acceder a mĆŗltiples procesadores. SĆ³lo hay que especificar multithread = TRUE para activarla. AtenciĆ³n, esta opciĆ³n no funciona bajo Windows.
Esta figura tomada de Hugerth y Andersson, 2017 ilustra la diferencia teĆ³rica entre OTUs y ASV. Cada color representa un clado. Las estrellas amarillas indican mutaciones, las rojas indican errores de amplificaciĆ³n o secuenciaciĆ³n. El tamaƱo del espacio entre las secuencias indica su agrupaciĆ³n.
(A) OTUs agrupadas con un 100% de identidad
La mĆ”s mĆnima variaciĆ³n en las secuencias provoca la creaciĆ³n de un nuevo grupo. Las secuencias mutantes y errĆ³neas se tratan de la misma manera.
(B) OTUs agrupadas con un 97% de identidad
Una agrupaciĆ³n mĆ”s amplia permite descartar las secuencias errĆ³neas, aunque las secuencias mutantes tambiĆ©n se agruparĆ”n en el grupo de consenso.
(C) ASVs
En teorĆa, el aprendizaje de la tasa de error permite agrupar las secuencias errĆ³neas con las secuencias de consenso. Sin embargo, las secuencias mutantes se consideran por derecho propio.
Ā”Comencemos!
Primero cargaremos la biblioteca DADA2. DeberĆa tener la Ćŗltima versiĆ³n: packageVersion('dada2').
A continuaciĆ³n, crearemos una variable path que indique la ruta de acceso a los objetos que necesitaremos.
library(dada2); packageVersion("dada2")## Loading required package: Rcpp## [1] '1.18.0'path <- "data/ITS_sub/"